過氧化氫酶是普遍存在于自然界的血紅素鐵酶。過氧化氫酶活性主要是分解H2O2，產(chǎn)生H2O和O2，以保護生物體不被過氧化氫毒害。當前，過氧化氫酶的主要研究方向為H2O2的分解機制及其生理功能研究，但過氧化氫酶的O2的代謝利用機制未見報道。有研究發(fā)現(xiàn)，過氧化氫酶EasC利用O2催化麥角生物堿核心骨架四并環(huán)結(jié)構(gòu)中C環(huán)合成時不需要額外添加NADPH等還原劑，推測其可能代表未知的氧氣激活與氧同化機制。

　　近日，中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所高書山團隊與杭州師范大學郭瑞庭團隊合作，破解了EasC蛋白底物復合體結(jié)構(gòu)，并利用波譜測定、體外生化、同位素標記和化學計算等手段，在分子水平闡明了EasC利用O2催化氧化環(huán)化反應的新機制。

　　該團隊通過電鏡獲得EasC酶與底物PCC的復合體結(jié)構(gòu)（2.33Å），發(fā)現(xiàn)EasC呈現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)PCC不是結(jié)合在heme口袋上方而是結(jié)合在過氧化氫酶共有的NADPH口袋。該位置距離heme口袋20.7Å，兩口袋之間通過一個狹長ROS通道相連。進一步，為探討EasC參與催化反應的鐵氧復合物類型，研究檢測了酶的波譜特征。在有氧條件下，研究將底物PCC和EasC酶進行快速混合，使用停留色譜檢測到416nm、544nm和590nm的最大吸收。該吸收區(qū)別于血紅素酶已報道的鐵-氧復合體Compound I的最大吸收，而與文獻報道的Compound III吸收一致，表明EasC中的血紅素鐵可能以Cpd III的方式參與催化反應。電子順磁共振和紫外吸收測試顯示，在有氧條件下，靜息態(tài)EasC的Fe(III)接收底物電子并與O2結(jié)合耦合，直接形成Cpd III。由于Cpd III可以分解生成超氧陰離子并回歸到靜息態(tài)Fe(III)，研究推測EasC催化過程或由超氧陰離子介導。因此，研究進一步通過活性氧抑制實驗、超氧陰離子恢復實驗以及18O標記的超氧陰離子自由基競爭性實驗，鑒定出氧氣被活化成超氧陰離子的活性氧形式、參與底物的轉(zhuǎn)化，而非傳統(tǒng)的鐵-氧復合物轉(zhuǎn)化底物。

　　基于上述實驗結(jié)果，該團隊提出了基于活性氧超氧陰離子的反應機制。結(jié)合在NADPH口袋的底物PCC，其吲哚氨基將一個電子傳遞給血紅素口袋的Fe(III)，后者同時和氧氣結(jié)合形成Fe(III)-O2•- (Cpd III)；Cpd III進一步分解成Fe(III)和超氧陰離子，生成的超氧陰離子通過兩個口袋之間的ROS通道進入NADPH口袋；超氧陰離子與底物PCC結(jié)合，催化復雜的氧化環(huán)化反應，完成麥角生物堿C環(huán)的合成。

　　這一研究闡釋了麥角生物堿核心骨架C環(huán)的生物合成機制，發(fā)現(xiàn)了過氧化氫酶EasC利用超氧陰離子以實現(xiàn)氧氣激活并進一步催化氧化環(huán)化反應。該機制代表了全新的血紅素金屬酶的催化模式即氧氣無需形成活性鐵-氧復合物。同時，該成果使過氧化氫酶的相關研究從H2O2依賴性酶轉(zhuǎn)向O2依賴性酶，拓展了過氧化氫酶這一生物催化劑的研究領域。

　　相關研究成果發(fā)表在《自然》（Nature）上。研究工作得到國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動專項等的支持。

超氧陰離子催化麥角生物堿C環(huán)的合成機制

過氧化氫酶生成超氧陰離子催化藥物合成示意圖